Les équipes quittent leur point de ravitaillement à la source de Funte Aretusa à Syracuse, en Italie, et parcourent 560 kilomètres en train et en ferry jusqu'à Rome, où elles recherchent un homme sur un scooter jaune et rouge. Elles reçoivent ensuite un indice leur indiquant de parcourir 1,6 kilomètre et de chercher des calèches où elles trouveront des porte-documents en cuir noir. Ces porte-documents contiennent des informations qui les aident à « décoder » un indice lié au film Da Vinci Code, ce qui permet à une équipe de remporter un prix. Elles se rendent ensuite à Athènes, en Grèce, à 1 070 kilomètres de là, et trouvent un marché à Agora. Une équipe prend de l'avance grâce à une épreuve de vitesse qui consiste à casser des assiettes, tandis que les autres parcourent 110 kilomètres en train jusqu'à la gare d'Ishthmos. Certaines équipes prennent du retard après un échec à l'épreuve du Fast Forward, tandis que d'autres commettent une erreur fatale en prenant le bus au lieu du train. L'épreuve du Roadblock exige qu'un membre de chaque équipe effectue un saut à l'élastique de plus de 60 mètres au-dessus du canal de Corinthe. Elle est immédiatement suivie d'un Détour : soit un Effort Herculéen (une série de jeux grecs : lancer de disque, lancer de javelot et lutte), soit une Épreuve de Grec (rechercher des lettres grecques sur un site archéologique et se faire aider par les locaux pour traduire afin de trouver le nom d'un lieu). Enfin, les équipes parcourent 172 kilomètres jusqu'à l'Arrivée finale à la forteresse de Rion, où deux équipes sont pénalisées pour leur erreur précédente et une autre est éliminée.